抗真菌药物筛选和活性评价指导手册

本书内容主要基于作者团队建立的多种用于抗真菌药物筛选和活性评价的医学真菌生物实验标准操作方法，旨在为真菌药物研发提供参考依据。主要内容分为四篇：第1篇，体外抗真菌活性筛选常用方法；第2篇，抗真菌作用机制研究常用方法；第3篇，真菌感染动物模型建立及体内抗真菌活性评价；第4篇，常用的真菌分子生物学实验及应用举例。
本书可为真菌相关研究的科研工作者提供标准和参考。

刘娜，海军军医大学药学系副教授、硕士研究生导师，研究方向为抗真菌药物研究，主要聚焦于抗真菌新靶点、新机制和新分子骨架发现。作为项目负责人主持国家自然科学基金面上项目（2项）、青年基金、军队生物安全研究专项等6项研究课题；作为项目骨干参与国家杰出青年科学基金、国家重点研发计划、上海市教委科技创新重大项目、上海市优秀学术带头人等项目。发表SCI论文27篇，获授权发明专利17项，参编中英文专著6部。作为主要完成人获得上海市科技进步二等奖，入选海军军医大学远航人才计划和A级优秀教员，担任《中南药学》杂志编委。

真菌感染是临床上一类常见病、多发病，分为深部真菌感染和浅部真菌感染。近年来，随着免疫受损人群的增加，深部真菌感染的发病率和致死率大幅上升。据统计，每年约有数十亿人会受到真菌感染，其中数百万人所受感染是危及生命的。目前用于深部真菌感染临床治疗的抗真菌药物数量十分有限，且普遍存在毒副作用大、耐药性严重等问题，现有的抗真菌药物远远不能满足临床的需要。因此，开发新型的抗真菌药物十分必要。国内抗真菌药物研发水平相对薄弱，抗真菌活性化合物发现和生物活性评价相对脱节，致使一些具有较好抗真菌活性的分子没有得以深入的研究和评价。海军军医大学盛春泉、刘娜团队多年来致力于抗真菌药物研究工作，建立了多种用于抗真菌药物筛选和活性评价的医学真菌生物实验标准操作方法，其中包括体外抗真菌活性测试方法、系统性真菌感染动物模型的构建、体内抗真菌活性评价方法，以及与真菌相关的细胞生物学、分子生物学实验方法，并以此为基础开展了大量的抗真菌新药发现和作用机制研究，以及抗真菌新靶点发现和验证工作。本书是这些方法的归纳总结，对从事真菌药物研发有重要的参考价值。

真菌感染是临床上一类常见病、多发病，分为深部真菌感染和浅部真菌感染。近年来，随着免疫受损人群的增加，深部真菌感染的发病率和致死率大幅上升。据统计，每年有数十亿人会受到真菌感染，其中数百万人所受感染是危及生命的。目前用于深部真菌感染临床治疗的抗真菌药物数量十分有限，且普遍存在毒副作用大、耐药性严重等问题，现有的抗真菌药物远远不能满足临床的需要。因此，开发新型的抗真菌药物十分必要。
药物研发的基本流程：首先，针对疾病或靶标建立生物活性评价方法；其次，筛选或者设计先导化合物；进而，对先导化合物进行结构优化的同时进行逐级评价，通常先体外评价生物活性和选择性，再通过动物模型测试体内生物活性。目前，国内抗真菌药物研发水平相对薄弱，抗真菌活性化合物发现和生物活性评价相对脱节，致使一些具有较好抗真菌活性的分子没有得以深入的研究和评价，而如何提高国内抗真菌药物研究的整体水平是业内同行共同关注的问题。
作者研究团队多年来致力于抗真菌药物研究工作，在参考大量文献的基础上，结合实际经验，建立了多种用于抗真菌药物筛选和活性评价的医学真菌生物实验标准操作方法，其中包括体外抗真菌活性测试方法、系统性真菌感染动物模型的构建、体内抗真菌活性评价方法，以及与真菌相关的细胞生物学、分子生物学实验方法，并以此为基础开展了大量的抗真菌新药发现和作用机制研究，以及抗真菌新靶点发现和验证工作。本书将上述真菌生物实验方法进行梳理、总结，形成了四部分内容：第1篇，体外抗真菌活性筛选常用方法；第2篇，抗真菌作用机制研究常用方法；第3篇，真菌感染动物模型建立及体内抗真菌活性评价；第4篇，常用的真菌分子生物学实验及应用举例。此外，附录中罗列了常见病原真菌活化、冻存方法以及常用培养基的配制方案，旨在为同行提供参考的依据，助力抗真菌药物的研究。
本书的编写是在多位老师和研究生的共同努力下完成的，书中的实验方法在国家自然科学基金重点项目（No. 82330109）、国家杰出青年科学基金（No. 81725020）、国家自然科学基金面上项目（No. 82373734，No. 81973175）等多项基金的资助下建立，本书的编写也得到多位同行的支持和帮助，在此一并表示感谢。
因学识和能力有限，书中难免存在不足之处，敬请读者批评指正。

编者
2024年6月

第1篇 体外抗真菌活性筛选常用方法  001
1 体外抗真菌活性测试  002
2 体外协同抗真菌活性测试  006
3 马拉色菌的体外抗真菌活性测试  010

第2篇 抗真菌作用机制研究常用方法  013
4 真菌与肿瘤细胞互作实验  014
5 平皿/纸片扩散实验  017
6 时间-生长曲线测试  020
7 时间-杀菌曲线测试  023
8 生物被膜形成抑制实验  026
9 成熟生物被膜清除实验  029
10 菌丝生长抑制实验  033
11 尿素酶生成抑制实验  036
12 黑素抑制实验  039
13 荚膜生长抑制实验  042
14 荚膜多糖含量测定实验  045
15 真菌细胞表面疏水性测试  048
16 透射电子显微镜实验  051
17 真菌细胞共定位成像  054
18 真菌活细胞激光共聚焦实时成像  057
19 甾醇含量测定实验  060
20 细胞周期实验  063
21 细胞凋亡实验  066

第3篇 真菌感染动物模型建立及体内抗真菌活性评价  069
22 小鼠系统性念珠菌感染模型  070
23 小鼠隐球菌性脑膜炎模型  073
24 小鼠皮肤感染模型  077
25 小鼠阴道炎感染模型  080
26 大蜡螟幼虫模型  084
27 线虫实验  087
28 血脑屏障透过实验  090

第4篇 常用的真菌分子生物学实验及应用举例  093
29 基因敲除技术  094
30 实时RT-PCR 实验  100
31 Western blot 实验  103
32 Hsp90 抑酶活性测试  106
33 HDAC 抑酶活性测试  110
34 组蛋白去甲基化酶抑酶活性测试  113

附录  121
附录1 常见病原真菌及其活化、冻存方法  122
附录2 常用培养基及缓冲溶液的配制方法  127
附录3 实验相关仪器  131
附录4 缩略语表  132

参考文献  134