生物实验室系列--现代分子生物学技术及实验技巧（第二版）

本书第一版广受读者欢迎。新版延续第一版内容特色，系统介绍现代分子生物学各种传统和新型的实验技术，涵盖核酸提取技术、目的基因的获取及鉴定技术、载体的构建和鉴定、细菌转化与细胞转染技术、外源基因表达的鉴定、报告基因分析、差异基因表达谱分析、蛋白质-核酸相互作用技术、蛋白质-蛋白质相互作用技术、微生物体内同源重组技术、转基因动物技术、基因编辑技术、流式细胞术实验方法、干细胞的分离培养与诱导分化、微RNA的构造及实验技术、长链非编码RNA研究实验技术、非编码RNA数据库及在线分析工具。
新版增加了CRISPR基因编辑技术、长链非编码RNA研究实验技术等新内容，并对非编码RNA数据库及在线分析工具一章进行重写。和第一版一样，实验方案部分强调对实验结果作具体分析，每个实验结果一般附图（照片），图中设阴阳性对照，对照图对实验结果进行详细分析，使读者对实验结果一目了然，还指出了每个技术的难点和解决办法。
本书是生物、医学领域相关实验室的案头实验操作工具书，可供从事生命科学研究的硕士、博士等科技工作者和教学一线教师日常查阅参考。

叶棋浓，军事科学院军事医学研究院某所科技委主任，研究员，博士生导师。国家杰出青年科学基金获得者，享受国务院政府特殊津贴。中国生物工程学会副秘书长、中国生物工程学会医学生物技术专业委员会主任委员、中国分析测试协会标记免疫分析专业委员会副主任委员。Frontiers in Cell and Developmental Biology和Frontiers in Oncology杂志副主编，Science Bulletin杂志特邀编委。主要从事肿瘤发生、侵袭、转移、耐药相关基因功能及机制研究，发现了新的调控重要信号转导通路的基因和非编码RNA，为肿瘤的诊断和治疗提供候选靶标。以通讯作者在Cancer Cell、Nature Communications、Science Advances、Journal of Clinical Investigation、Advanced Science、Science Bulletin、STTT等SCI杂志上发表文章90余篇。获北京市科学技术一等奖1项，军队科技进步二等奖1项。

一版广受欢迎，新版维持一版内容特色。系统介绍现代分子生物学各种传统和新型的实验技术，新版增加了CRISPR基因编辑技术、长链非编码RNA研究实验技术等新内容，并对非编码RNA数据库及在线工具一章进行重写。实验方案部分强调对实验结果作具体分析，每个实验结果都附图（照片），图中设阴阳性对照，对照图对实验结果进行详细分析，使读者对实验结果一目了然，还指出了每个技术的难点和解决办法。 分子生物学工作者案头常备实验手册工具书。

分子生物学是从分子水平对生物学进行研究的科学，现代分子生物学技术的诞生使生命科学的发展得以大力推进，分子生物学技术在生物学、医学、农林业、制药学等多个领域得到了广泛的应用。该技术是目前从事生命科学研究的重要手段，是每个从事这个领域的科技工作者都必须熟练掌握的基本技术。
编写本书的目的在于弥补以往的书籍中对实验结果分析的缺乏，本书强调对实验结果作具体的分析，如需附结果的图或照片，图中要有阴阳性对照等。结合照片分析研究结果，列举实验中经常遇到的问题及可能的解决方法是本书的特色。读者阅读后在实验结果解读和改进实验方法等方面都能豁然开朗。此外，本书在编写的内容上也力求全面，第一到六章包括分子克隆所需的技术，从基因的提取、克隆到目的基因的表达；第七到十三章分别介绍了报告基因分析、差异基因表达谱分析、蛋白质与核酸/蛋白质的相互作用、微生物体内同源重组技术、基因编辑和转基因动物等技术；最后五章则对流式细胞术、干细胞的分离培养与诱导分化技术、微RNA、长链非编码RNA，以及非编码RNA数据库及在线分析工具进行了介绍。本书适合所有从事生命科学研究的科技工作者、教师和研究生使用。
本书大多由工作在第一线的青年科技工作者和博士研究生撰写，由于时间仓促，加上编者水平有限，书中难免有疏漏和不妥之处，恳请读者指正。

叶棋浓
军事医学研究院生物工程研究所
2024年4月于北京

第一章分子生物学技术概述1
一、引言1
二、目的基因的获取1
三、克隆载体的选择2
四、载体的转化2
五、重组子的筛选3
六、基因表达4
七、生物工程技术的应用5
参考文献6

第二章核酸提取技术7
第一节质粒DNA的提取7
一、引言7
二、碱裂解法小量质粒提取所需的仪器、材料及基本步骤8
三、Promega质粒DNA小量提取试剂盒操作程序9
四、注意事项9
五、实验结果说明10
六、疑难解析10
第二节基因组DNA的提取12
一、引言12
二、从植物组织提取基因组DNA13
三、从动物组织提取基因组DNA14
四、细菌基因组DNA的制备14
五、用DNA提取试剂盒从全血和组织中提取基因组DNA15
六、注意事项17
七、实验结果说明17
八、疑难解析18
第三节RNA的提取19
一、引言19
二、实验设计思路和基本步骤20
三、实验结果说明24
四、疑难解析24
参考文献25

第三章目的基因的获取及鉴定技术26
第一节普通PCR26
一、普通PCR的基本概念和原理26
二、普通PCR技术的实验方法27
三、疑难解析32
第二节实时荧光定量PCR33
一、实时荧光定量PCR的基本概念和原理33
二、实时荧光定量PCR的定量方法36
三、实时荧光定量PCR的实验方法42
四、实时荧光定量PCR技术的应用47
五、疑难解析53
第三节环介导等温扩增法快速检测病原菌55
一、引言55
二、环介导等温核酸扩增的原理57
三、实验设计思路和基本步骤59
四、实验结果66
五、疑难解析69
六、小结70
参考文献72

第四章载体的构建和鉴定76
第一节克隆载体76
一、pBR322载体76
二、pUC8——一种Lac选择型质粒78
三、pGEM3Z——克隆DNA的体外转录78
四、柯斯质粒载体78
第二节表达载体79
一、原核表达载体80
二、真核表达载体82
第三节载体构建中的关键工具和步骤87
一、关键工具87
二、常规克隆关键步骤89
三、同源重组克隆关键步骤91
第四节载体构建的应用举例92
一、常规克隆实验材料92
二、常规克隆实验方法93
三、同源重组克隆实验材料97
四、同源重组克隆实验方法98
五、疑难问题解析100
参考文献100

第五章细菌转化与细胞转染技术102
第一节细菌转化102
一、基本原理102
二、实验设计思路和基本步骤103
三、实验结果及分析104
四、疑难解析104
第二节细胞转染105
一、基本原理106
二、实验设计和基本步骤108
三、实验结果及分析110
四、疑难解析111
参考文献112

第六章外源基因表达的鉴定113
第一节Northern Blot113
一、引言113
二、实验设计思路和基本步骤113
三、实验结果说明116
四、疑难解析117
第二节RT-PCR117
一、引言117
二、实验设计思路和基本步骤117
三、实验结果说明120
四、疑难解析120
第三节Western Blot121
一、引言121
二、实验设计思路和基本步骤121
三、实验结果说明126
四、疑难解析126
第四节ELISA127
一、引言127
二、实验设计思路和基本步骤129
三、实验结果说明131
四、疑难解析131
参考文献132

第七章报告基因分析134
第一节报告基因的定义和种类134
一、报告基因的定义134
二、常用的报告基因134
第二节应用报告基因分析基因的转录活性135
一、实验原理135
二、实验设计和基本步骤136
三、实验结果分析137
四、疑难解析140
第三节报告基因在动物活体成像中的应用140
一、实验原理140
二、实验设计和基本步骤142
三、实验结果分析143
四、疑难解析143
参考文献145

第八章差异基因表达谱分析147
第一节基于双向电泳技术的蛋白质组学分析147
一、引言147
二、实验基本步骤和注意事项147
三、双向电泳实验结果说明及疑难解析154
四、质谱数据分析说明及疑难解析154
五、结语159
第二节基因芯片160
一、引言160
二、工作原理161
第三节基因芯片的制备163
一、概述163
二、探针的选择和制备163
三、基因芯片基片的选择和准备165
四、基因芯片的制作166
第四节基因芯片的检测168
一、基因芯片的杂交和数据获取168
二、基因芯片分析常用的软件和数据库169
第五节基因芯片的应用170
一、基因芯片与病原微生物检测170
二、基因芯片与肿瘤172
三、基因芯片与药物研发174
四、结语176
参考文献176

第九章蛋白质-核酸相互作用技术178
第一节凝胶迁移实验178
一、引言178
二、实验设计与基本步骤179
三、实验举例与结果说明184
四、需要注意的问题186
第二节染色质免疫共沉淀技术187
一、引言187
二、实验基本步骤188
三、实验举例189
四、实验注意事项192
第三节RNA沉降192
一、实验基本原理192
二、实验基本思路192
三、实验举例说明197
第四节RIP实验198
一、实验基本原理198
二、实验思路199
三、注意事项200
四、实验举例说明201
参考文献201

第十章蛋白质-蛋白质相互作用技术202
第一节运用酵母双杂交技术筛选与靶蛋白相互作用的蛋白质202
一、引言202
二、实验仪器及材料203
三、实验设计流程204
四、实验方法204
五、实验结果说明210
六、疑难解析214
第二节GST沉降214
一、实验基本原理214
二、实验基本步骤215
三、实验举例217
四、实验注意事项221
第三节免疫共沉淀222
一、引言222
二、实验设计和基本步骤223
三、实验结果举例225
四、需要注意的问题227
第四节细胞共定位228
一、引言228
二、实验设计和基本步骤228
三、实验结果举例说明229
四、实验注意事项230
参考文献231

第十一章微生物体内同源重组技术232
第一节传统的大肠杆菌体内同源重组方法（RecA重组系统）232
一、引言232
二、利用RecA重组系统构建痢疾杆菌hns基因插入突变体232
三、RecA重组系统构建突变体的其他方法235
四、存在的问题和解决方法236
五、小结236
第二节Red/ET重组系统237
一、引言237
二、痢疾杆菌hns基因缺失突变体的构建238
三、Red同源重组技术应用策略241
四、应用Gap-Repair克隆技术构建pBR322-Red载体242
五、Red/ET重组系统的其他应用244
六、小结245
参考文献245

第十二章转基因动物技术247
第一节转基因动物概述247
一、转基因动物的概念247
二、转基因动物的分类247
三、转基因动物的命名248
四、转基因动物技术的基本原理249
五、转基因动物的安全性和伦理学问题250
六、转基因动物技术的发展概况251
第二节显微注射法制备转基因动物252
一、仪器设备及材料和试剂252
二、实验动物准备253
三、转基因动物制备方法254
四、影响转基因动物产生效率的因素257
第三节利用ES细胞制备转基因动物258
一、ES细胞的研究历史258
二、ES细胞的生物学特性258
三、ES细胞分离培养的基本方法259
四、ES细胞的遗传修饰263
五、转基因动物制备270
参考文献271

第十三章基因编辑技术272
第一节基因打靶技术273
一、基因打靶技术的原理273
二、利用同源重组构建基因打靶动物模型的基本步骤273
三、基因打靶的策略276
四、基因打靶的生物学意义和应用前景287
第二节CRISPR/Cas9系统288
一、CRISPR/Cas系统的简介及其作用原理288
二、TypeⅡ CRISPR/Cas9系统289
三、CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用举例291
四、CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用前景295
第三节CRISPR/Cas13系统296
一、CRISPR/Cas13系统的介绍296
二、实验基本步骤296
三、注意事项298
四、实验结果说明298
五、疑难解析300
参考文献300

第十四章流式细胞术实验方法305
一、引言305
二、实验方法308
三、实验结果分析313
四、流式细胞分析的质量控制323
参考文献325

第十五章干细胞的分离培养与诱导分化327
第一节人胎盘来源间充质干细胞的分离培养与纯化327
一、引言327
二、材料、试剂与主要仪器设备328
三、实验方法329
四、实验结果332
五、注意事项337
第二节小鼠间充质干细胞的分离培养与纯化338
一、引言338
二、骨髓法339
三、密质骨法339
第三节人胚胎干细胞的培养348
一、引言348
二、实验材料348
三、实验方法348
四、注意事项352
第四节CD34+造血干细胞与CD14+单核细胞向树突状细胞的诱导分化353
一、引言353
二、实验材料与方法354
三、实验结果357
四、注意事项359
参考文献359

第十六章微RNA的构造及实验技术364
第一节miRNA克隆364
一、材料与设备365
二、实验方法365
三、疑难解析368
第二节miRNA Northern Blot368
一、材料与设备368
二、实验方法369
三、疑难解析369
第三节miRNA原位杂交370
一、材料与设备370
二、实验方法371
三、疑难解析371
第四节基于poly（A）加尾的miRNA RT-PCR372
一、材料与设备372
二、实验方法373
三、疑难解析374
第五节miRNA功能研究375
一、miRNA表达检测375
二、miRNA功能筛选鉴定376
三、miRNA靶基因鉴定377
四、miRNA非经典功能378
第六节siRNA的构造及实验研究379
一、引言379
二、如何进行RNAi实验381
三、常用RNAi实验的基本步骤384
四、实验结果说明388
五、疑难解析389
参考文献390

第十七章长链非编码RNA研究实验技术392
第一节lncRNA克隆392
一、材料与设备393
二、实验方法393
三、实验注意事项396
第二节lncRNA Northern Blot396
一、材料与设备396
二、实验方法396
三、实验注意事项397
第三节lncRNA原位杂交398
一、材料与设备398
二、实验方法398
三、实验注意事项399
第四节lncRNA定量检测400
一、材料与设备400
二、实验方法400
三、实验注意事项400
第五节lncRNA-蛋白质互作研究技术401
一、RNA pull-down鉴定特定lncRNA结合的蛋白质401
二、RIP鉴定特定蛋白质结合的lncRNA免疫沉淀技术404
三、CLIP鉴定蛋白质与lncRNA的结合位点405
四、ChIRP鉴定与lncRNA结合的蛋白质/DNA408
参考文献412

第十八章非编码RNA数据库及在线分析工具介绍414
第一节综合性非编码RNA数据库414
一、概论414
二、非编码RNA相关数据库415
三、小结425
第二节miRNA相关数据库及预测工具425
一、概论425
二、miRNA相关数据库425
三、miRNA相关预测工具434
四、小结442
第三节rRNA相关数据库及预测工具442
一、概述442
二、rRNA相关数据库442
三、rRNA相关预测工具448
四、小结449
第四节sRNA相关数据库及预测工具450
一、概述450
二、sRNA相关数据库450
三、sRNA靶标相关预测工具452
四、小结454
第五节siRNA相关数据库454
一、概述454
二、siRNA相关数据库454
第六节tRNA相关数据库及预测工具460
一、概述460
二、tRNA相关数据库460
三、tRNA相关预测工具470
四、小结472
第七节snoRNA相关数据库及预测工具472
一、概述472
二、snoRNA相关数据库472
三、snoRNA相关预测工具473
四、小结476
第八节lncRNA及circRNA相关数据库477
一、概论477
二、lncRNA及circRNA相关数据库477
三、小结497
参考文献498