壳聚糖衍生物纳米疫苗技术与应用

本书分别以N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒、N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖纳米粒以及N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖-铝纳米粒作为疫苗佐剂和递送载体，以猪流行性腹泻灭活病毒为模型抗原，研制新型猪流行性腹泻纳米灭活疫苗，并系统地研究了该疫苗的相关性能和免疫效力。本书是一本系统论述壳聚糖衍生物作为疫苗佐剂和递送系统的学术专著，可为疫苗佐剂的研制以及进口替代和原始创新提供技术理论支撑并奠定应用基础。
本书适宜于从事疫苗佐剂、动物疫苗、壳聚糖衍生物开发及在纳米生物材料等领域从事科研、教学、规划、设计、生产、管理等工作的人员阅读使用，尤其对从事疫苗佐剂研发和聚合物递送载体材料研究的相关科研工作者和专业学生具有重要的参考价值。

赵凯，教授，博导，享受省政府特殊津贴，国家“万人计划”科技创新领军人才和科技部“创新人才推进计划”中青年科技创新领军人才入选者，教育部新世纪优秀人才支持计划。担任中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会常务理事、黑龙江省畜牧兽医学会常务理事、黑龙江省畜牧兽医学会动物传染病分会副理事长、黑龙江省微生物学会常务理事、黑龙江省蛋白质组学学会常务理事、黑龙江省发酵工程学会常务理事、黑龙江省免疫学会理事、黑龙江省生物工程学会理事。 主要从事动物疫苗佐剂及递送系统、纳米检测试剂和生物制药方面的科学研究工作。近年主持国家自然科学基金面上5项、国家重点研发计划2项、科技部国际合作专项、教育部重点、黑龙江省杰出青年科学基金、黑龙江省自然科学基金重点项目、黑龙江省科技攻关项目、哈尔滨市科技攻关项目等科研课题32项。

本书是一部利用纳米聚合物制备技术，以可生物降解材料壳聚糖的衍生物作为载体，以猪流行性腹泻灭活疫苗为模型药物，应用纳米技术对它们进行剂型改换，制备新型缓释猪流行性腹泻灭活病毒疫苗，并通过动物免疫实验评价该疫苗的综合免疫效果的学术专著，作者结合多年的多项重大科研成果，并参阅了大量的国内外文献撰写而成。全书共分十章。在内容安排上注重了科学性、先进性、系统性和条理性，图文并茂，体例规范，语言通顺流畅，涉及内容丰富而广泛。该研究内容属于国家重点研发项目内容。

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的一种急性、接触性强的肠道传染疾病，感染仔猪死亡率高，致使养猪业遭受巨大经济损失。疫苗免疫是预防猪流行性腹泻等传染病最有效的方法之一。灭活疫苗具有高水平免疫、高稳定性、高保护率等优点，但猪流行性腹泻病毒灭活疫苗存在抗原呈递及加工的有效性差、生物利用度低等缺点。免疫佐剂是指提前或与抗原一起注射到机体内能提高免疫效果及改变免疫应答类型的一种非特异性免疫增强剂。安全有效的疫苗佐剂的研制及开发对猪流行性腹泻病毒灭活疫苗免疫效果的提高至关重要。
黏膜疫苗可在黏膜部位有效诱导对病原体的保护性免疫反应，也可在全身诱导抗原特异性的体液免疫和细胞介导的免疫反应。黏膜接种还能有效诱导持久性B淋巴细胞和T淋巴细胞的记忆。此外，黏膜途径接种疫苗与全身途径接种疫苗相比具有生产成本低、无注射损伤风险、消除疼痛和恐惧等优势。
提高疫苗黏膜免疫效力的关键是用优良的黏膜免疫佐剂，合适的黏膜佐剂能够诱导机体分泌大量的免疫球蛋白A（IgA)，并通过激活B细胞和树突状细胞（DC细胞）诱导全身免疫。疫苗佐剂通常是免疫刺激分子，如细胞因子、Toll样受体或其他病原体等，而基于病原体类的疫苗佐剂容易引起机体非必要的免疫反应，甚至造成细胞毒性反应。壳聚糖等非病毒生物材料作为疫苗佐剂，能诱导机体产生强烈的体液、细胞和局部黏膜免疫应答反应，同时具有良好的生物安全性。研究表明，壳聚糖衍生物纳米颗粒是最有前途的疫苗佐剂和递送载体之一。壳聚糖可以通过多种方式进行改性，以提高黏膜给药疫苗的有效性。壳聚糖衍生物可以保护抗原不被降解，增加抗原在黏膜表面的停留时间，通过配体受体相互作用将抗原靶向M细胞，在免疫系统中大量传递抗原，有效诱导全身和黏膜免疫应答反应。
在《壳聚糖衍生物纳米疫苗技术与应用》一书中，主要分为两大部分进行论述，第一部分包括第一章至第四章，该部分综述了关于猪流行性腹泻、疫苗佐剂、黏膜免疫以及壳聚糖及其衍生物等相关研究热点，介绍了如何解决黏膜疫苗发展面临的一些关键科学技术问题，为壳聚糖衍生物黏膜佐剂发展提供基础知识和构建思路，这也是本书编写的必要性和重要性所在。第二部分包括第五章至第九章，该部分分别以N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒、N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖纳米粒以及N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖-铝（Al）纳米粒作为疫苗佐剂和递送载体，以猪流行性腹泻灭活病毒为模型抗原，研制新型猪流行性腹泻纳米灭活疫苗，并系统地研究了该疫苗的相关性能和免疫效力。本书是一本系统论述壳聚糖衍生物作为疫苗佐剂和递送系统的学术专著，可为疫苗佐剂的研制以及进口替代和原始创新提供技术理论支撑并奠定应用基础。
本书由赵凯教授和金政教授撰稿，其中部分内容参考了硕士研究生曲婉莹、赵东莹、于爽和郭思含的毕业论文，也感谢硕士研究生赵志、董大鹏、巩晓晨和彭雪，他（她）们为本书的资料整理做了大量的工作。全书由赵凯教授审核修改。
感谢浙江省“尖兵”和“领雁”研发计划（2022C02031）、浙江省重点研发计划（2021C02049）、国家重点研发计划子课题（2017YFD0500603）、黑龙江省杰出青年科学基金（JC2018008）、黑龙江省属高校科技成果培育项目（TSTAU-C2018017）、2022年度台州市科技计划项目（22nya04）和台州市创新平台产学研合作专项等科研项目的资助。

赵凯
2023年7月
于台州学院生命科学学院

第一章 猪流行性腹泻001
第一节　猪流行性腹泻病毒001
一、猪流行性腹泻病毒形态001
二、猪流行性腹泻病毒的分子生物学特点001
三、猪流行性腹泻病毒致病机制及危害004
四、猪流行性腹泻病毒的转运感染途径005
五、猪流行性腹泻的流行情况006
六、猪流行性腹泻病毒基因进化树分析007
第二节　猪流行性腹泻的诊断与控制008
一、免疫诊断技术008
二、分子生物学技术012
第三节　猪流行性腹泻病毒疫苗研究现状014
一、猪流行性腹泻病毒疫苗发展历程014
二、猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗016
三、猪流行性腹泻病毒灭活疫苗018
四、猪流行性腹泻病毒基因工程疫苗019

第二章 疫苗佐剂023
第一节　免疫佐剂的作用及机理023
第二节　免疫佐剂的分类024
一、化学类免疫佐剂025
二、微生物类免疫佐剂026
三、天然生物类免疫佐剂028
四、生物类免疫佐剂036
五、含脂类物质036

第三章 黏膜免疫038
第一节　概述038
第二节　黏膜免疫系统040
第三节　黏膜免疫接种041
一、黏膜免疫疫苗041
二、黏膜免疫接种途径041
第四节　黏膜免疫疫苗佐剂和输送系统042
第五节　黏膜免疫中的聚合物纳米粒子045
一、壳聚糖及其衍生物在黏膜疫苗中的应用045
二、PLGA 在黏膜疫苗中的应用047
三、透明质酸在黏膜疫苗中的应用047
四、脂类在黏膜疫苗中的应用048
五、PCL 纳米粒在黏膜疫苗中的应用048
六、纳米聚酸酐在黏膜疫苗中的应用049
七、聚磷腈纳米颗粒在黏膜疫苗中的应用049
八、普鲁兰纳米颗粒在黏膜疫苗中的应用050
九、海藻酸纳米颗粒在黏膜疫苗中的应用051

第四章 壳聚糖及其衍生物052
第一节　壳聚糖052
一、概述052
二、壳聚糖属性053
第二节　改性壳聚糖衍生物054
一、提高壳聚糖的溶解性054
二、提高壳聚糖对pH 的敏感性058
三、提高壳聚糖靶向性能059
第三节　壳聚糖基纳米颗粒060
一、乳液交联060
二、离子交联061
三、溶剂蒸发061
四、喷雾干燥061
五、沉淀或絮凝061
六、壳聚糖溶液涂层062
第四节　壳聚糖衍生物在药物递送中的应用062
一、壳聚糖载体状态062
二、运载药物062
第五节　壳聚糖衍生物在黏膜免疫中的应用065

第五章 N-2-HACC纳米粒佐剂068
第一节　N-2-HACC 纳米粒佐剂制备装置068
一、快速膜乳化装置结构068
二、N-2-HACC 纳米粒制备装置操作方法068
第二节　N-2-HACC 纳米粒的优化070
一、N-2-HACC 纳米粒制备方法070
二、N-2-HACC 纳米粒制备工艺的优化方法070
三、N-2-HACC 纳米粒制备条件的优化结果071
第三节　优化的N-2-HACC 纳米粒佐剂制备工艺及其理化性能079
一、N-2-HACC 纳米粒佐剂最佳制备工艺079
二、N-2-HACC 纳米粒形态、粒径分布、Zeta电位测定080
第四节　N-2-HACC/PEDV 的制备及其免疫效果评价081
一、PEDV-SZ 株（PEDV-SZ） 的增殖与灭活081
二、N-2-HACC/PEDV 疫苗的制备及免疫效果评价方法082
三、N-2-HACC/PEDV 的免疫效果评价083
四、N-2-HACC/PEDV 纳米疫苗设计对免疫效果影响分析084

第六章 N-2-HACC/CMCS 纳米粒佐剂086
第一节　N-2-HACC/CMCS 纳米粒佐剂制备条件的优化086
一、常用溶液的配制086
二、N-2-HACC/CMCS 纳米粒的制备方法086
三、N-2-HACC/CMCS 纳米粒的制备工艺优化方法087
四、N-2-HACC/CMCS 纳米粒添加剂量的确定088
第二节　N-2-HACC/CMCS 纳米粒工艺优化及免疫应用088
一、N-2-HACC/CMCS 纳米粒制备条件的优化088
二、N-2-HACC/CMCS/PEDV 制备及免疫效果评价098

第七章 N-2-HACC/PEDV/CMCS NP101
第一节　N-2-HACC/PEDV/CMCS NP 制备工艺优化101
一、N-2-HACC/PEDV/CMCS NP 的制备101
二、N-2-HACC/PEDV/CMCS NP 制备工艺的优化方法101
三、N-2-HACC/PEDV/CMCS NP 制备工艺的优化结果102
第二节　N-2-HACC/PEDV/CMCS NP 理化特性分析112
一、N-2-HACC/PEDV/CMCS NP 理化特性分析方法112
二、N-2-HACC/PEDV/CMCS NP 理化特性分析结果113
第三节　N-2-HACC/PEDV/CMCS NP 稳定性和释放性研究114
一、N-2-HACC/PEDV/CMCS NP 稳定性和释放性研究方法114
二、N-2-HACC/PEDV/CMCS NP 稳定性和释放性研究结果116
三、纳米疫苗结果分析119

第八章 多糖对猪流行性腹泻N-2-HACC/CMCS纳米粒灭活疫苗免疫效果的影响120
第一节　不同佐剂猪流行性腹泻纳米灭活疫苗的筛选120
一、相关溶液的配制方法120
二、猪流行性腹泻病毒的增殖与灭活121
三、不同佐剂猪流行性腹泻纳米灭活疫苗的制备方法121
四、最佳佐剂组合猪流行性腹泻纳米灭活疫苗的筛选方法123
五、最佳佐剂组合猪流行性腹泻纳米灭活疫苗的筛选结果124
第二节　N-2-HACC/铝胶/APS/PEDV/CMCS的理化特性126
一、N-2-HACC/铝胶/APS/PEDV/CMCS 的pH检测126
二、N-2-HACC/铝胶/APS/PEDV/CMCS 表面形态126
三、N-2-HACC/铝胶/APS/PEDV/CMCS 粒径分布126
四、N-2-HACC/铝胶/APS/PEDV/CMCS 包封率、载药量的测定126
第三节　N-2-HACC/铝胶/APS/PEDV/CMCS 的安全性检测128
一、N-2-HACC/铝胶/APS/PEDV/CMCS 的无菌检验128
二、N-2-HACC/铝胶/APS/PEDV/CMCS 的体内安全性检验129
第四节　N-2-HACC/铝胶/APS/PEDV/CMCS稳定性考察132
一、耐酸性测定132
二、肠溶性测定133
三、耐胆盐测定133
四、体外释放性的考察134
第五节　N-2-HACC/铝胶/APS/PEDV/CMCS免疫效果的评价135
一、免疫效果的评价方法135
二、免疫效果的评价结果137
三、免疫效果分析149

第九章 N-2-HACC-Al 纳米佐剂在猪流行性腹泻灭活疫苗中作用效果的评价152
第一节　N-2-HACC-Al NP 合成工艺条件的优化152
一、溶液及其配制方法152
二、N-2-HACC-Al NP 的合成154
三、单因素优化N-2-HACC-Al NP 合成工艺条件154
四、N-2-HACC-Al NP 合成工艺条件优化的响应面设计160
第二节　N-2-HACC-Al NP 理化性能测定166
一、N-2-HACC-Al NP 形态和粒径的测定166
二、铝结合效率和N-2-HACC 结合效率的测定167
三、N-2-HACC-Al NP 颗粒表面元素分布169
第三节　N-2-HACC-Al NP 稳定性和安全性评价170
一、N-2-HACC-Al NP 的稳定性分析170
二、N-2-HACC-Al NP 的体外降解性考察172
三、N-2-HACC-Al NP 的细胞毒性检测172
第四节　N-2-HACC-Al NP/PEDV 的制备和免疫效果评价174
一、N-2-HACC-Al NP/PEDV 的制备174
二、N-2-HACC-Al NP/PEDV 免疫效果的评价方法175
三、N-2-HACC-Al NP/PEDV 免疫效果的评价结果176
四、免疫增强效果分析187

参考文献190